Agencia Estatal Boletín Oficial del Estado

LA EXPERIENCIA ADQUIRIDA EN LA APLICACION DE LA REGLAMENTACION PARA LA ELABORACION, CIRCULACION Y COMERCIO DE HELADOS, APROBADA POR DECRETO 2130/1974, DE 20 DE JULIO, Y MODIFICADA POSTERIORMENTE POR EL REAL DECRETO 670/1983, DE 2 DE MARZO, CON EXCEPCION DE LAS NORMAS MICROBIOLOGICAS QUE SE REGIAN POR EL REAL DECRETO 2580/1980, DE 14 DE NOVIEMBRE, HA PUESTO DE RELIEVE LA NECESIDAD DE MODIFICAR DICHAS NORMAS MICROBIOLOGICAS.

POR OTRA PARTE, CADA DIA SE ESTIMA MAS NECESARIO EL QUE LA DETERMINACION MICROBIOLOGICA, SE EFECTUE PARTIENDO DE MUESTRAS SIGNIFICATIVAS QUE TENGAN CONEXION EN EL SISTEMA ANALITICO UTILIZADO. EN ESTE SENTIDO, Y PARA LAS DETERMINACIONES QUE SE CONTEMPLAN EN LA PRESENTE DISPOSICION, SE HACE PRECISO DIFERENCIAR DOS TIPOS DE CIRCUNSTANCIAS QUE EXIJAN METODOLOGIAS DIFERENCIADAS: EN FABRICAS Y ALMACENES EN DONDE EXISTEN CONSIDERABLES CANTIDADES DE HELADOS Y EN MINORISTAS, PUESTOS DE TEMPORADA, ETC., DONDE UNICAMENTE SE ENCUENTRAN PEQUEÑAS CANTIDADES DE ESTOS PRODUCTOS.

EN SU VIRTUD, PREVIO INFORME PRECEPTIVO DE LA COMISION INTERMINISTERIAL PARA LA ORDENACION ALIMENTARIA, A PROPUESTA DE LOS MINISTROS DE ECONOMIA Y HACIENDA, DE INDUSTRIA Y ENERGIA, DE AGRICULTURA, PESCA Y ALIMENTACION Y DE SANIDAD Y CONSUMO Y PREVIA DELIBERACION DEL CONSEJO DE MINISTROS EN SU REUNION DEL DIA 30 DE ENERO DE 1987,

DISPONGO:

ARTICULO UNICO. SE MODIFICA EL ARTICULO 9 DEL REAL DECRETO 670/1983, DE 2 DE MARZO, POR EL QUE SE APRUEBA LA REGLAMENTACION TECNICO-SANITARIA PARA LA ELABORACION, CIRCULACION Y COMERCIO DE HELADOS, QUE QUEDARA REDACTADO DE LA FORMA SIGUIENTE:

<ART. 9. LOS METODOS DE TOMA DE MUESTRAS, SU TRANSPORTE Y CONSERVACION, TOLERANCIAS MICROBIOLOGIA Y LOS METODOS DE ANALISIS DE LOS HELADOS, SON LOS QUE APARECEN ESPECIFICADOS EN EL ANEXO UNICO DEL PRESENTE REAL DECRETO.>

DISPOSICION TRANSITORIA

SE AUTORIZA AL MINISTERIO DE SANIDAD Y CONSUMO PARA QUE MEDIANTE ORDEN Y PREVIO INFORME DE LA COMISION INTERMINISTERIAL PARA LA ORDENACION ALIMENTARIA, PUEDAN SER MODIFICADAS LAS TOLERANCIAS MICROBIOLOGICAS CONTENIDAS EN EL PRESENTE REAL DECRETO.

LOS MINISTERIOS PROPONENTES PODRAN MEDIANTE ORDEN Y PREVIO INFORME DE LA COMISION INTERMINISTERIAL PARA LA ORDENACION ALIMENTARIA, MODIFICAR LAS ESPECIFICACIONES QUE SOBRE TOMA DE MUESTRAS Y METODOS DE ANALISIS FIGURAN EN EL CITADO ANEXO.

DISPOSICION DEROGATORIA

QUEDA DEROGADO EL REAL DECRETO 2580/1980, DE 14 DE NOVIEMBRE, POR EL QUE SE MODIFICA EL ARTICULO 10 DE LA REGLAMENTACION TECNICO-SANITARIA PARA LA ELABORACION, CIRCULACION Y COMERCIO DE HELADOS, APROBADA POR EL DECRETO 2130/1974, DE 20 DE JULIO, Y CUANTAS DISPOSICIONES DE IGUAL O INFERIOR RANGO SE OPONGAN A LO DISPUESTO EN EL PRESENTE REAL DECRETO.

DISPOSICION FINAL

LA PRESENTE DISPOSICION ENTRARA EN VIGOR A LOS TREINTA DIAS DE SU PUBLICACION EN EL <BOLETIN OFICIAL DEL ESTADO>.

DADO EN MADRID A 30 DE ENERO DE 1987.JUAN CARLOS R.

EL MINISTRO DE RELACIONES CON LAS CORTESY DE LA SECRETARIA DEL GOBIERNO, VIRGILIO ZAPATERO GOMEZ

ANEXO UNICO

NORMAS MICROBIOLOGICAS PARA HELADOS

PRIMERA.

TOMA DE MUESTRAS.

LA TOMA DE MUESTRAS DE LOS HELADOS, DESTINADOS A SER ANALIZADOS CON EL FIN DE DETERMINAR SU STANDARD MICROBIOLOGICO SE HARA POR TRIPLICADO, SEGUN EL REAL DECRETO 1945/1983, DE 22 DE JUNIO, Y DE ACUERDO CON LOS SIGUIENTES METODOS:

A) SE TOMARAN CINCO MUESTRAS DEL MISMO LOTE. LOS ENVASES O CAJAS SERAN ORIGINALES, NO ABIERTOS E INTEGROS.

B) EN AQUELLOS CASOS EN DONDE NO SE PUEDAN TOMAR EL NUMERO DE MUESTRAS INDICADO EN EL APARTADO A), POR FALTA DE CANTIDAD SUFICIENTE DE UN MISMO LOTE, SE TOMARA UNA MUESTRA.

EN EL CASO DE MUESTRAS EN ENVASES ABIERTOS, CADA MUESTRA SERA, DE HASTA 250 MILILITROS DE VOLUMEN Y SE RECOGERAN EN RECIPIENTES ESTERILIZADOS, PRECINTADOS Y CON ESPATULAS ASIMISMO ESTERILES.

SEGUNDA. TRANSPORTE Y CONSERVACION DE LAS MUESTRAS.

PARA TRANSPORTAR LAS MUESTRAS Y SU CONSERVACION HASTA EL MOMENTO DE SU ANALISIS, SE DISPONDRA DE LOS ELEMENTOS FRIGORIFICOS NECESARIOS PARA QUE LA MUESTRA OBTENIDA EN TODO MOMENTO MANTENGA LAS CARACTERISTICAS ADECUADAS PARA NO DESVIRTUAR LA FINALIDAD DEL ANALISIS.

TERCERA.

TOLERANCIAS MICROBIOLOGICAS.

CUARTA.

METODOS DE ANALISIS.

1. RECUENTO TOTAL DE MICROORGANISMOS AEROBIOS REVIVIFICABLES.

ES LA DETERMINACION DEL NUMERO TOTAL DE MICROORGANISMOS AEROBIOS REVIVIFICABLES POR GRAMO O MILILITRO DE ALIMENTO.

DISOLVER LOS INGREDIENTES POR CALENTAMIENTO. AJUSTAR EL PH A 7. DISTRIBUIR EN TUBOS O MATRACES Y ESTERILIZAR DURANTE VEINTE MINUTOS A 121 C.

TECNICA: CADA MUESTRA SE HACE POR DUPLICADO, EMPLEANDO DOS SERIES DE PLACAS.

A PARTIR DE LA <SERIE DE DILUCIONES DECIMALES>, CON PIPETA ESTERIL DE 1 ML, SE PONE ESTA CANTIDAD DE CADA UNA DE LAS DILUCIONES DECIMALES EN OTRAS TANTAS PLACAS DE PETRI ESTERILES. A CONTINUACION SE VIERTEN 15 ML DEL MEDIO DE CULTIVO, PREVIAMENTE ENFRIADO A 47 C, SOBRE CADA UNA DE LAS PLACAS. SE MEZCLA SUAVEMENTE, MOVIENDO LA PLACA VARIAS VECES EN UN SENTIDO Y OTRAS TANTAS EN EL SENTIDO CONTRARIO. SE DEJAN SOLIDIFICAR Y SE INCUBAN EN POSICION A 31 C, DURANTE SETENTA Y DOS HORAS.

PASADO EL TIEMPO DE INCUBACION, SE CUENTA EL NUMERO DE COLONIAS QUE HAN CRECIDO EN EL MEDIO, SOLAMENTE EN AQUELLAS PLACAS QUE CONTENGAN ENTRE 50 150 COLONIAS. EL NUMERO DE COLONIAS POR GRAMO O MILILITRO DE ALIMENTO SE CALCULA MUTIPLICANDO EL NUMERO DE COLONIAS CONTADO POR EL FACTOR DE DILUCION DE LA PLACA.

2. INVESTIGACION Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIACEAE LACTOSA POSITIVA (COLIFORME).

NUMERACION DE COLIFORMES:

ES LA DETERMINACION DEL NUMERO TOTAL DE <COLIFORMES> POR GRAMO O MILILITRO DE ALIMENTO.

1. NUMERACION EN PLACA. TECNICA DE NUMERACION SOBRE MEDIO VRBG (VIOLET-RED-BILE-AGAR).

DISOLVER POR CALENTAMIENTO. AJUSTAR EL PH A 7.4. MANTENER EN EBULLICION DURANTE DOS MINUTOS. NO NECESITA ESTERILIZACION EN AUTOCLAVE. PARA SU USO SE DEBE ENFRIAR A 45 C.

TECNICA: A PARTIR DE LA <SERIE DE DILUCIONES DECIMALES>, Y POR DUPLICADO, SE AÑADE 1 ML DE CADA DILUCION SOBRE PLACAS DE PETRI ESTERILES. EN CADA PLACA SE VIERTEN 15 ML DEL MEDIO DE CULTIVO VRBG A 45 C. MEZCLAR CUIDADOSAMENTE.

DESPUES DE LA SOLIDIFICACION DEL MEDIO, SE VIERTEN SOBRE CADA PLACA 3-4 ML DEL MISMO MEDIO DE CULTIVO LICUADO, ESTERIL, PARA EVITAR EL CRECIMIENTO EN SUPERIFICIE Y LA EXTENSION DE LAS COLONIAS, HACIENDO ASI MAS FACIL LA NUMERACION DE LAS MISMAS.

LAS PLACAS, EN POSESION INVERTIDA, SE INCUBAN A 31C DURANTE VEINTICUATRO HORAS.

LAS COLONIAS DE <COLIFORMES> APARECEN EN ESTE MEDIO CON TONALIDAD ROJO PURPURA Y RODEADAS DE UNA ZONA DE PRECIPITACION DE LAS SALES BILIARES.

PARA NUMERAR LOS COLIFORMES POR ESTA TECNICA, SE ELIGEN LAS PLACAS QUE CONTENGAN ENTRE 30 Y 150 COLONIAS CARACTERISTICAS. EL NUMERO DE COLONIAS CONTADAS Y CONFIRMADAS SE MULTIPLICA POR EL FACTOR DE DILUCION DE LA PLACA, OBTENIENDO ASI EL NUMERO TOTAL DE <COLIFORMES> POR GRAMO O MILIMETRO DE ALIMENTO.

ESTAS COLONIAS DEBEN SER CONFIRMADAS COMO <COLIFORMES>, PARA LO CUAL SE TOMAN DIEZ COLONIAS REPRESENTATIVAS DE CADA TIPO CARACTERISTICO Y SE SIEMBRA CADA UNA DE ELLAS SOBRE CALDO BGBL, CON CAMPANA DURHAM. INCUBAR A 31 C Y EXAMINAR A LAS VEINTICUATRO-CUARENTA Y OCHO HORAS PARA COMPROBAR SI SE HA FORMADO GAS. SOLAMENTE LAS COLONIAS QUE HAN DADO LUGAR A LA PRODUCCION DE GAS SE CONSIDERAN <COLIFORMES>.

2. NUMERACION EN TUBOS. TECNICA DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP) SOBRE MEDIO DE CULTIVO CALDO LACTOSADO-BILIADO AL VERDE BRILLANTE (BGBL).

DISOLVER. AJUSTAR EL PH A 7.4. DISTRIBUIR EN TUBOS CON CAMPANA DURHAM A RAZON DE 10 ML. ESTERILIZAR DURANTE VEINTE MINUTOS A 121 C.

TECNICA: SE PREPARAN TRES SERIES DE TRES TUBOS CONTENIENDO MEDIO BGBL CON CAMPANA.

A CADA TUBO DE LA PRIMERA SERIE SE LE AÑADE 1 ML DE LA DILUCION DEL ALIMENTO AL 1:10. EN CADA UNO DE LOS TRES TUBOS DE LA SEGUNDA SERIE SE PONE A 1 ML DE LA DILUCION AL 1:100, HACIENDO LO MISMO CON LOS TUBOS DE LA TERCERA SERIE, A LOS QUE SE AÑADE 1 ML DE LA DILUCION 1:1.000.

LOS TUBOS DE LAS TRES SERIE SE INCUBAN A 31 C, LEYENDOSE LOS RESULTADOS A LAS VEINTICUATRO-CUARENTA Y OCHO HORAS. LOS QUE PRESENTEN GAS SE CONSIDERAN POSITIVOS, Y EL NUMERO DE <COLIFORMES> POR GRAMO O MILILITRO DE ALIMENTO SE LEE EN LAS TABLAS DE NMP.

3. IDENTIFICACION ESCHERICHIA COLI:

CONSISTE EN PONER DE MANIFIESTO LA PRESENCIA DE E. COLI MEDIANTE IDENTIFICACION POR TECNICAS ADECUADAS.

DISOLVER POR CALENTAMIENTO. AJUSTAR EL PH A 6.9. DISTRIBUIR EN TUBOS CON CAMPANA DURHAM A RAZON A 10 ML POR TUBO. SOMETER A ESTERILIZACION EN AUTOCLAVE DURANTE 15 MINUTOS A 121 C.

B) AGAR LEVINE.

TECNICA: LOS TUBOS DE BGBL CON CAMPANA DURHAM QUE MUESTREN GAS DESPUES DEL PERIODO DE INCUBACION CUANDO SE EMPLEA LA TECNICA DEL NMP SE AGITAN SUAVEMENTE, Y CON ASA DE CULTIVO DE TRES MM DE DIAMETRO SE SIEMBRAN SOBRE TUBOS QUE CONTENGAN MEDIO EC CON CAMPANA. ESTOS TUBOS SE INCUBAN DURANTE CUARENTA Y OCHO HORAS EN BAÑO MARIA REGULADO A 45 C. DESPUES DE VEINTICUATRO HORAS DE INCUBACION SE EXAMINA PARA SABER SI HAY PRODUCCION DE GAS Y, EN CASO NEGATIVO, SE MANTIENEN HASTA LAS CUARENTA Y OCHO HORAS PARA HACER LA LECTURA DEFINITIVA.

DE LOS TUBOS CON GAS EL CALDO EC SE SIEMBRA CON ASA DE CULTIVO SOBRE AGAR LEVINE PARA OBTENER COLONIAS AISLADAS. LAS PLACAS SE INCUBAN VEINTICUATRO HORAS A 37 C. LAS COLONIAS CARACTERISTICAS DE E. COLI PRESENTAN UN CENTRO OSCURO, CON O SIN BRILLO METALICO.

LAS COLONIAS SOSPECHOSAS CRECIDAS EN AGAR LEVINE SE SIEMBRAN SOBRE TUBOS DE PCA INCLINADO Y SE SOMETEN A INCUBACION DURANTE DIECIOCHO-VEINTICUATRO HORAS A 37 C. ESTE CULTIVO SE UTILIZA PARA EL ESTUDIO DE LAS CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS Y TINTORIALES DEL GERMEN Y PARA LAS PRUEBAS BIOQUIMICAS.

COMPROBADAS POR OBSERVACION MICROSCOPICA LAS CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS Y TINTORIALES DE LA CEPA ESTUDIADA (BACILOS CORTOS GRAM NEGATIVOS) SE REALIZAN LAS PRUEBAS BIOQUIMICAS: INDOL, ACETIL-METIL-CARBINOL (VOGES-PROSIUER), ROJO DE METILO Y UTILIZACION DEL CITRATO:

A) FORMACION DE INDOL (I): A PARTIR DEL CRECIMIENTO SOBRE PCA SE SIEMBRA UN TUBO DE AGUA DE TRIPTONA (TW), INCUBANDO VEINTICUATRO HORAS A 37 C. A CONTINUACION SE LE AÑADE UN ML DE REACTIVO DE KOVACS. EN CASO POSITIVO APARECE UN ANILLO ROJO EN LA SUPERFICIE DEL MEDIO.

B) PRUEBA DE VOGES-PROSIUER (V): SE SIEMBRAN DOS TUBOS DEL MEDIO MR-VP POR CADA COLONIA A IDENTIFICAR, INCUBABLE A 37C DURANTE CUARENTA Y OCHO HORAS.

EN UNO DE LOS TUBOS SE INVESTIGA LA PRESENCIA DE ACETIL-METIL-CARBINOL, CON EL OTRO TUBO SE REALIZA POSTERIORMENTE LA PRUEBA DEL ROJO DE METILO.

PARA DETECTAR EL ACETIL-METIL-CARBINOL SE AÑADE AL TUBO 0,6 ML DE LA SOLUCION A Y 0,2 ML DE LA SOLUCION B. AGITAR, Y PARA INTENSIFICAR LA REACCION SE AÑADEN UNOS CRISTALES DE CREATININA. SE HACE LA LECTURA A LAS CUATRO HORAS. LA REACCION POSITIVA REVELA UN COLOR ROJO.

C) PRUEBA DEL ROJO DE METILO (M): EN EL TUBO RESTANTE CONTENIENDO UN CULTIVO EN MR-VP SE AÑADEN 0,3 ML DE LA SOLUCION ROJO DE METILO. UNA PRUEBA POSITIVA SE MANIFIESTA POR UNA COLORACION ROJA.

D) UTILIZACION DE CITRATO (C): A PARTIR DEL CRECIMIENTO EN PCA SE SIEMBRA UNA PEQUEÑA CANTIDAD SOBRE CALDO CITRATO DE KOSER. INCUBACION A 37C DURANTE CUARENTA Y OCHO HORAS. LA REACCION ES POSITIVA CUANDO APARECE TURBIDEZ DEL MEDIO.

LOS CULTIVOS QUE DEN LUGAR A FORMACION DE GAS, SEAN BACILOS CORTOS GRAM NEGATIVOS Y QUE LA PRUEBA IMVIASE AJUSTE A: ++- O -+--, SE CONSIDERAN E.

COLI.

D) IDENTIFICACION DE ST. AUREUS:

ES LA DETERMINACION DE LA PRESENCIA O AUSENCIA DE ST. AUREUS POR GRAMO O MILILITRO DE ALIMENTO.

4. RECUENTO DE STAPHYLOCOCUS AUREUS (ST. AUREUS):

ES EL NUMERO DE ST. AUREUS POR GRAMO O MILILITRO DE PRODUCTO CUANDO SE EMPLEA UN METODO ADECUADO.

MATERIAL:

PIPETAS DE UN ML ESTERILES.

PLACAS DE PETRI ESTERILES DE 90 MM.

ASA DE CULTIVO.

ASA DE VIDRIO.

GRADILLAS.

ESTUFA DE CULTIVO.

MEDIO DE CULTIVO Y REACTIVOS:

A) MEDIO GIOLITTI CANTONI.

DISOLVER POR CALENTAMIENTO HASTA EBULLICION. AJUSTAR AL PH A 6.9. DISTRIBUIR A RAZON DE 19 ML POR TUBO. ESTERILIZAR DURANTE VEINTE MINUTOS A 121 C.

ENFRIAR RAPIDAMENTE Y AÑADIR A CADA TUBO 0,3 ML DE UNA SOLUCION DE TELURITO AL 3,5 POR 100, ESTERILIZADA POR FILTRACION.

B) CALDO EXTRACTO CEREBRO-CORAZON (BHI).

DISOLVER POR CALENTAMIENTO HASTA EBULLICION. AJUSTAR EL PH A 7.4. REPARTIR EN TUBOS DE ENSAYO A RAZON DE 10 ML. ESTERILIZARA 121 C DURANTE 20 MINUTOS. SE CONSERVA VARIOS MESES EN REFRIGERACION.

C) MEDIO BAIRD-PARKER.

DISOLVER POR CALENTAMIENTO. AJUSTAR EL PH A 6.9. ESTERILIZAR DURANTE 20 MINUTOS A 121 C. ENFRIAR A 50 C Y AÑADIR 50 ML DE EMULSION ESTERIL DE YEMA DE HUEVO Y 3 ML DE SOLUCION DE TELURITO POTASICO AL 3,5 POR 100, ESTERILIZADA POR FILTRACION. MEZCLAR BIEN. REPARTIR EN PLACAS DE PETRI.

PARA PREPARAR LA SOLUCION DE SULFAMETAZINA SE DISUELVEN 0,5 G DE SULFAMETAZINA PURA EN 25 ML DE HIDROXIDO SODICO N 10 Y SE COMPLETA HASTA 250 ML CON AGUA DESTILADA. ESTA SOLUCION SE AÑADE AL MEDIO, ANTES O DESPUES DE SER SOMETIDO AL AUTOCLAVE.

D) PARAFINA PUNTO DE FUSION 42 C-44 C.

E) AGAR DNSA.

DISOLVER POR CALENTAMIENTO. AJUSTAR EL PH A 7.3. DISTRIBUIR A RAZON DE 15 ML Y ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE 15 MINUTOS A 121 C. PREPARAR PLACAS DE PETRI.

F) PLASMA DE CONEJO CON ACIDO ETILODIAMINOTETRACETICO (EDTA).

EL PLASMA EDTA NO DA REACCIONES DE COAGULASA FALSAS POR LOS GERMENES QUE UTILIZAN CITRATOS.

G) SOLUCION DE ACIDO CLORHIDRICO 1N.

H) SOLUCION DE AZUL DE TOLUIDINA.

A) TECNICA PARA INVESTIGACION DE PRESENCIA O AUSENCIA DE ST. AUREUS.

ESTA TECNICA SE USA CUANDO SE SOSPECHA LA EXISTENCIA DE MAS DE 100 ST. AUREUS POR GRAMO O MILILITRO DE ALIMENTO.

DE LA SOLUCION MADRE SE SIEMBRA 1 ML, POR DUPLICADO, SOBRE EL MEDIO GIOLITTI CANTONI. CUBRIR EL MEDIO SEMBRADO CON UNA CAPA DE 2-3 CM DE PARAFINA ESTERIL, LICUADA PREVIAMENTE. INCUBAR A 37 C 24-48 HORAS. AL CABO DE ESTE TIEMPO LOS CULTIVOS QUE PRESENTAN COLORACION O PRECIPITADO NEGRO SE CONSIDERAN PRESUNTAMENTE POSITIVOS. EL CALDO GIOLITTI CANTONI CONTIENE TELURITO, GLICINA Y CLORURO DE LITIO, QUE SON INHIBIDORES DE MICROORGANISMOS NO STAPHYLOCOCUS COAGULASA POSITIVOS. POR OTRA PARTE EL TELURITO ES REDUCIDO A TELURO SOLAMENTE POR LOS MISMOS MICROORGANISMOS, DANDO COMO REACCION EL ENNEGRECIMIENTO DEL MEDIO. ESTE MEDIO ES DE ENRIQUECIMIENTO. SI SE PRODUCE ENNEGRECIMIENTO DEL MEDIO GIOLITTI CANTONI, SE SIEMBRA 0,1 ML DE LOS TUBOS ENNEGRECIDOS SOBRE EL MEDIO BAIRD-PARKER, DISEMINANDO CON ASA DE VIDRIO ESTERIL. LAS PLACAS SEMBRADAS INCUBAN EN POSICION INVERTIDA, A 37 C DURANTE 48 HORAS COMO MAXIMO. DE LAS PLACAS QUE PRESENTEN COLONIAS CARACTERISTICAS NEGRAS, BRILLANTES, CONVEXAS, RODEADAS DE UNA ZONA CLARA QUE PUEDE SER TAMBIEN PARCIALMENTE OPACA, SE SELECCIONAN 5 COLONIAS PARA LLEVAR A CABO SU CONFIRMACION BIOQUIMICA.

B) INVESTIGACION DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP) DE ST. AUREUS.

ESTE METODO SE ACONSEJA CUANDO SE SOSPECHA LA EXISTENCIA DE MENOS DE 100 ST.

AUREUS POR GRAMO O MILILITRO DE ALIMENTO.

A PARTIR DE LA <SERIE DE DILUCIONES DECIMALES>, SE SIEMBRA 1 ML DE LA DILUCION 10 EN UNA SERIE DE TRES TUBOS CONTENIENDO EL MEDIO GIOLITTI CANTONI. DE LA DILUCION 10 SE SIEMBRA 1 ML EN CADA UNO DE OTRA SERIE DE TRES TUBOS CONTENIENDO EL MISMO MEDIO, Y FINALMENTE, DE LA DILUCION 10 SE SIEMBRA 1 ML EN CADA TUBO DE OTRA SERIE DE TRES TUBOS. UNA VEZ SEMBRADOS, TODOS LOS TUBOS SE CUBREN CON UNA CAPA DE PARAFINA PREVIAMENTE FUNDIDA Y, UNA VEZ SOLIDIFICADA ESTA, SE SOMETEN A UNA INCUBACION A 37 C DURANTE 48 HORAS. LOS TUBOS EN LOS QUE APAREZCA ENNEGRECIMIENTO DEL MEDIO AL CABO DE ESTE TIEMPO SE RESIEMBRAN EN PLACAS DE BAIRD-PARKER, INCUBANDOSE A 37 C DURANTE 48 HORAS. EL NUMERO DE GERMENES VIENE DADO POR LAS TABLAS DEL NMP, SEGUN LAS PLACAS QUE SE HAN CONFIRMADO POSITIVAS.

LAS COLONIAS QUE HAN MOSTRADO UN CRECIMIENTO CARACTERISTICO EN EL MEDIO BAIRD-PARKER SE PASAN AISLADAS A CALDO BHI PARA CONFIRMACION BIOQUIMICA DE LAS MISMAS. PARA ESTA CONFIRMACION SE SUELEN SELECCIONAR 5 COLONIAS CARACTERISTICAS.

C) RECUENTO DE COLONIAS DE ST. AUREUS EN PLACAS.

A PARTIR DE LA <SERIE DE DILUCIONES DECIMALES>, SE SIEMBRA 0,1 ML DE CADA DILUCION SOBRE OTRAS TANTAS PLACAS DE PETRI CONTENIENDO MEDIO BAIRD-PARKER Y EXTENDIENDO PERFECTAMENTE CON ASA DE VIDRIO ESTERIL. UNA VEZ SECA LA SUPERFICIE SEMBRADA, SE INCUBAN LAS PLACAS EN POSICION INVERTIDA A 37 C DURANTE 48 HORAS. OBSERVAR EL CRECIMIENTO CARACTERISTICO DE LAS COLONIAS SOBRE ESTE MEDIO. SE SELECCIONAN 5 COLONIAS TIPICAS PARA SU CONFIRMACION BIOQUIMICA.

POR ESTA TECNICA, EL NUMERO DE COLONIAS REFERIDAS A GRAMO O MILILITRO DE ALIMENTO VIENE DADO POR EL RECUENTO DE COLONIAS TIPICAS CONFIRMADAS BIOQUIMICAMENTE MULTIPLICADO POR EL FACTOR DE DILUCION.

D) PRUEBAS DE CONFIRMACION BIOQUIMICA.

COAGULASA: CADA COLONIA CARACTERISTICA SELECCIONADA EN EL MEDIO DE BAIRD-PARKER SE SIEMBRA SOBRE TUBOS CONTENIENDO MEDIO BHI INCUBAR A 37 C DURANTE 20-24 HORAS.

A 0,3 ML DE PLASMA DE CONEJO CONTENIDO EN TUBOS ESTERILES DE 1075 MM SE LE AÑADE 0,1 ML DE CULTIVO OBTENIDO SOBRE BHI INCUBAR A 37 C Y EXAMINAR SI SE PRODUCE COAGULACION DEL PLASMA EN EL TRANSCURSO DE 6 HORAS.

DESOXIRRIBONUCLEASA (DNSA): A PARTIR DE COLONIAS CARACTERISTICAS SOBRE BAIRD-PARKER SE SIEMBRA EN ESTRIAS RADIALES SOBRE LA SUPERFICIE DEL AGAR DNSA. INCUBAR A 37 C DURANTE 18-24 HORAS. AL CABO DE ESTE TIEMPO, CUBRIR EL MEDIO CON SOLUCION DE ACIDO CLORHIDRICO Y ESPERAR UNOS MINUTOS. LA REACCION ES POSITIVA SI LOS CULTIVOS PRESENTAN UNA ZONA TRANSPARENTE ALREDEDOR. SE PUEDE USAR COMO REACTIVO AZUL DE TOLUIDINA EN VEZ DE ACIDO CLORHIDRICO; EN ESTE CASO, LA REACCION SE CONSIDERA POSITIVA SI APARECE UNA COLORACION ROSADA ALREDEDOR DE LA ESTRIA.

SI LAS PRUEBAS CONFIRMATIVAS SON POSITIVAS, SEGUN TECNICA DESCRITA B, SE EMPLEA PARA CONOCER EL NUMERO DE GERMENES POR GRAMO O MILILITRO DE ALIMENTO, LA TABLA DEL NMP.

EN EL CASO DE RECUENTO EN PLACAS EL NUMERO DE COLONIAS CARACTERISTICAS SE MULTIPLICA POR EL FACTOR DE DILUCION DE LA PLACA Y LA CIFRA OBTENIDA ES EL NUMERO DE COLONIAS POR GRAMO O MILILITRO DE ALIMENTO.

LAS PRUEBAS DE CONFIRMACION SE DEBEN HACER, SIMULTANEAMENTE, CON CEPAS COAGULADAS Y DNSA POSITIVAS Y NEGATIVAS, COMO CONTROL.

5.

INVESTIGACION DE SALMONELLA.

ES LA DETERMINACION DE LA PRESENCIA O AUSENCIA DE ESTOS MICROORGANISMOS POR METODOS ADECUADOS.

MATERIAL:

PIPETAS DE 1 ML ESTERILES.

ESTUFA DE CULTIVO.

ASA DE CULTIVO.

PLACAS DE PETRI DE 140 MM DE DIAMETRO.

PLACAS DE PETRI DE 90 MM DE DIAMETRO.

MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y ANTISUEROS:

AGUA PEPTONA TAMPONADA.

MEDIO MULLER-IUFFMANN AL TETRATIONATO.

MEDIO SELENITO VERDE BRILLANTE (STOKES Y OSBORNE).

AGAR VERDE BRILLANTE-ROJO FENOL (BGA MODIFICADO).

AGAR DESOXICOLATO CITRATO.

AGAR HEKTOEN.

AGAR LACTOSA BILIS CRISTAL VIOLETA-ROJO NEUTRO (VRB).

AGAR HIERRO TRIPLE AZUCAR (TSI).

AGAR UREA (CHRISTENSEN).

AGAR NUTRIENTE SEMISOLIDO.

SOLUCION SALINA.

MEDIO PARA DECARBOXILACION DE LA LISINA.

REACTIVO BETA GALACTOSIDASA.

REACCION VOGES-PROSIUER.

ANTISUEROS ESPECIFICOS.

A) PREPARACION DE AGUA DE PEPTONA TAMPONADA.

DISOLVER EL YODURO POTASICO EN UN VOLUMEN MINIMO DE AGUA Y AÑADIR EL YODO.

AGITAR HASTA DISOLUCION COMPLETA Y PONER EN ENVASE OPACO BIEN CERRADO.

4. SOLUCION DE VERDE BRILLANTE:

AÑADIR EL VERDE BRILLANTE AL AGUA. MANTENER LA SOLUCION UN DIA EN OSCURIDAD PARA QUE SE PRODUZCA LA AUTOESTERILIZACION.

5. SOLUCION DE BILIS DE BUEY:

AÑADIR A LA BASE, ASEPTICAMENTE, LOS DEMAS INGREDIENTES EN EL ORDEN EXPUESTO. EL MEDIO COMPLETO SE DISTRIBUYE A RAZON DE 100 ML, ASEPTICAMENTE, EN MATRACES ESTERILES DE 500 ML DE CAPACIDAD.

ALMACENAR A 4 C EN OSCURIDAD EN EL TRANSCURSO DE UNA SEMANA.

C) PREPARACION DEL MEDIO SELENITO VERDE BRILLANTE (STOKES Y OSBORNE).

1. MEDIO BASE:

DISOLVER LOS CUATRO PRIMEROS INGREDIENTES EN AGUA POR EBULLICION DURANTE CINCO MINUTOS. DESPUES AÑADIR EL SELENITO. AJUSTAR EL PH A 7.

ALMACENAR A 4 C EN LA OSCURIDAD HASTA SU USO EN EL TRANSCURSO DE UNA SEMANA.

AÑADIR LA SOLUCION BUFFER A LA BASE. CALENTAR A 80 C. ENFRIAR Y AÑADIR LA SOLUCION DE VERDE BRILLANTE.

EL MEDIO ASI PREPARADO SE REPARTE EN MATRACES DE 500 ML ESTERILES A RAZON DE 100 ML.

SE USA EL MISMO DIA DE SU PREPARACION.

D) PREPARACION DE AGAR VERDE BRILLANTE-ROJO FENOL (BGA).

DISOLVER POR CALENTAMIENTO. AJUSTAR EL PH A 7, NO NECESITA AUTOCLAVE. DEJAR ENFRIAR HASTA 50 C Y VERTER EN PLACAS DE 140 MM DE DIAMETRO, DEJANDO SOLIDIFICAR.

INMEDIATAMENTE ANTES DEL USO, SE SACARAN LAS PLACAS CUIDADOSAMENTE EN ESTUFA A 50C DURANTE TREINTA MINUTOS.

E) PREPARACION DE AGAR DESOXICOLATO CITRATO.

DISOLVER POR CALENTAMIENTO. AJUSTAR EL PH A 7.3. ESTE MEDIO ES SENSIBLE AL CALOR, NO NECESITA AUTOCLAVE, SE DEBE USAR RECIEN PREPARADO. SE VIERTE A TEMPERATURA DE 50 C EN CAPA ESPESA SOBRE PLACAS DE PETRI DE 90 MM DE DIAMETRO. LAS PLACAS HAN DE ESTAR SECAS ANTES DE SU EMPLEO.

F) AGAR HEKTOEN.

DISOLVER POR CALENTAMIENTO HASTA EBULLICION. AJUSTAR EL PH A 7.5. ENFRIAR A 60 C Y DISTRIBUIR EN PLACAS DE PETRI ESTERILES. NO NECESITA AUTOCLAVE.

G) PREPARACION DE AGAR-LACTOSA BILIS CRISTAL VIOLETA ROJO NEUTRO (V.R.B).

DISOLVER POR CALENTAMIENTO. AJUSTAR EL PH A 7. DISTRIBUIR EL MEDIO EN TUBOS O MATRACES A RAZON DE 15 ML. ESTE MEDIO NO NECESITA ESTERILIZACION. SI SE PREPARA DE ANTEMANO, NO DEBERA PERMANECER MAS DE UNA SEMANA EN REFRIGERADOR.

LAS PLACAS DE 90 MM DE DIAMETRO SE PREPARAN A PARTIR DEL MEDIO LICUADO Y DEJANDOLAS SECAS EN ESTUFA A 50C DURANTE TREINTA MINUTOS.

H) PREPARACION DEL AGAR HIERRO TRIPLE AZUCAR (TSI).

DISOLVER POR CALENTAMIENTO. AJUSTAR EL PH A 7.4. REPARTIR EN TUBOS DE 160 16 MM, A RAZON DE 10 ML POR TUBO. ESTERILIZAR QUINCE MINUTOS A 121 C. LOS TUBOS, PARA SU SOLIDIFICACION, SE COLOCAN DE FORMA QUE SE OBTENGA UN FONDO DE UNOS TRES CM DE LARGO Y EL PLANO INCLINADO LA MISMA DIRECCION.

I) PREPARACION DEL AGAR UREA (CHRISTENSEN) .

1. MEDIO BASE.

DISOLVER POR CALENTAMIENTO. AJUSTAR EL PH A 6.8. ESTERILIZAR QUINCE MINUTOS A 121 C.

2. PREPARACION DE LA SOLUCION DE UREA.

AÑADIR LA SOLUCION DE UREA EN CONDICIONES ASEPTICAS SOBRE EL MEDIO BASE.

AJUSTAR EL PH A 6.8. DISTRIBUIR EN TUBOS ESTERILES A RAZON DE 10 ML POR TUBO.

SOLIDIFICAR EN POSICION INCLINADA.

J) PREPARACION DE AGAR NUTRIENTE SEMISOLIDO .

DISOLVER POR CALENTAMIENTO. AJUSTAR EL PH A 7. REPARTIR UN MATRACES CUYA CAPACIDAD NO SEA SUPERIOR A 500 ML. ESTERILIZAR VEINTE MINUTOS A 121 C. EL MEDIO RECIEN PREPARADO SE DISTRIBUYE EN PLACAS DE 90 MM, A RAZON DE QUINCE ML CADA PLACA. ESTAS PLACAS NO SE SECAN.

K) PREPARACION DE SOLUCION SALINA.

DISOLVER EL CLORURO SODICO EN AGUA POR CALENTAMIENTO. AJUSTAR EL PH A 7. DISTRIBUIR EN MATRACES A RAZON DE 100 ML. ESTERILIZAR VEINTE MINUTOS A 121 C.

L) PREPARACION DEL MEDIO PARA LA DESCARBOXILACION DE LA LISINA.

DISOLVER POR CALENTAMIENTO. AJUSTAR EL PH A 6.8. DISTRIBUIR A RAZON DE 5 ML EN TUBOS ESTRECHOS DE 160 8 MM. ESTERILIZAR DIEZ MINUTOS A 121 C.

M) PREPARACION DEL REACTIVO PARA BETA-GALACTOSIDASA .

1. SOLUCION <BUFFER>.

SOLUCION DE HIDROXIDO SODICO, APROXIMADAMENTE, 0,1 N (4G/LITRO) 3 G AGUA DESTILADA HASTA UN VOLUMEN FINAL 50 ML

DISOLVER EL ORTOFOSFATO EN 45 ML, APROXIMADAMENTE, DE AGUA. AJUSTAR EL PH A 7 CON TRES ML, APROXIMADAMENTE, DE SOLUCION DE HIDROXIDO SODICO. AÑADIR AGUA HASTA UN VOLUMEN FINAL DE 50 ML.

ALMACENAR EN REFRIGERACION.

2. SOLUCION O. N. P. G.

DISOLVER EL O. N. P. G. EN AGUA A 50 C. ENFRIAR LA SOLUCION.

3. REACTIVO COMPLETO.

AÑADIR LA SOLUCION <BUFFER> A LA O. N. P. G. ALMACENAR EL REACTIVO COMPLETO EN FRIGORIFICO, PERO NO MAS DE UN MES.

N) REACCION DE VOGES-PROSIUER.

YA DESCRITA EN PRUEBA DE VOGES PROSIUER. VER 3. IDENTIFICACION ESCHERICHIA COLI, APARTADO <TECNICA>, PUNTO B).

REACCION DE INDOL .

YA DESCRITA EN FORMACION DE INDOL. VER 3. IDENTIFICACION ESCHERICHIA COLI, APARTADO <TECNICA>, PUNTO A).

O) ANTISUEROS ESPECIFICOS .

LOS SUEROS SE OBTIENEN COMERCIALMENTE O EN EL INSTITUTO <PASTEUR>.

SUEROS ANTI O:

MONOVALENTES.

POLIVALENTES.

SUEROS ANTI VI.

SUEROS ANTI H:

MONOVALENTES.

POLIVALENTES.

TECNICA: LA MUESTRA REPRESENTATIVA DEBE SER, AL MENOS, DE 100 G. DE ESTA MANERA SE HARA UNA PESADA, DE DISTINTAS ZONAS, DE 25 G.

TRITURACION Y HOMOGENEIZACION: EL LIQUIDO DE DILUCION EMPLEADO EN ESTA NORMA ES EL AGUA DE PEPTONA TAMPONADA. VER APARTADO <METODOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y ANTISUEROS>, PUNTO A). SE MEZCLAN 225 ML DE AGUA DE PEPTONA TAMPONADA CON LOS 25 G DE ALIMENTO. SE LLEVA AL TRITURADOR-HOMOGENEIZADOR TRITURANDO ENTRE 8.000 Y 10.000 REVOLUCIONES POR MINUTO DURANTE DOS MINUTOS.

SI LA MUESTRA ES MAS PEQUEÑA SE HACE PROPORCIONALMENTE LA DILUCION, TENIENDOLO EN CUENTA AL DAR LOS RESULTADOS.

EL ALIMENTO TRITURADO NECESITA UN AJUSTE DE PH ENTRE 6-7, PARTICULARMENTE EN ALIMENTOS ACIDOS, DONDE LA SALMONELLA NO PUEDE DESARROLLARSE.

PRE-ENRIQUECIMIENTO: EL CONTENIDO DEL HOMOGENEIZADOR SE PASA ASEPTICAMENTE A MATRACES ESTERILES DE 500 ML, POR DUPLICADO. INCUBAR A 37 C ENTRE 16 Y 20 HORAS COMO MAXIMO.

ENRIQUECIMIENTO: UNA VEZ INCUBADO, PASAR 10 ML AL MATRAZ CONTENIENDO EL MEDIO AL TETRATIONATO (MULLER-IUFFMANN) Y OTROS 10 ML AL MEDIO SELENITO VERDE BRILLANTE.

EL MEDIO AL TETRATIONATO SEMBRADO SE INCUBA CUARENTA Y OCHO HORAS A 42-43 C Y EL MEDIO AL SELENITO DURANTE CUARENTA Y OCHO HORAS A 37 C.

SIEMBRA EN PLACAS: CUANDO LA INCUBACION DE AMBOS MEDIOS ALCANZA VEINTICUATRO HORAS SE SIEMBRA A PARTIR DE CADA UNO, CON ASA DE CULTIVO, LA SUPERFICIE DE PLACAS CONTENIDO: AGAR-VERDE BRILLANTE-ROJO FENOL (B. G. A.), AGAR-DESOXICOLATOCITRATO Y AGAR HEKTOEN, CON EL FIN DE OBTENER COLONIAS AISLADAS (PRIMER SUBCULTIVO). INCUBAR LAS PLACAS A 37C DURANTE CUARENTA Y OCHO HORAS.

DESPUES DE LAS CUARENTA Y OCHO HORAS SE REPITE LA SIEMBRA A PARTIR DE LOS MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO SOBRE LOS MISMOS MEDIOS SELECTIVOS (SEGUNDO SUBCULTIVO). A LAS VEINTICUATRO HORAS DE INCUBACION DE LAS PLACAS SE LEEN LOS RESULTADOS OBSERVANDO EL ASPECTO DE LAS COLONIAS CRECIDAS EN CADA MEDIO:

SE TOMAN COLONIAS TIPICAS DE CADA MEDIO Y SE CONFIRMAN, LO QUE REQUIERE CIERTA EXPERIENCIA, YA QUE EL ASPECTO DE LAS MISMAS PUEDE VARIAR, NO SOLO DE ESPECIE A ESPECIE, SINO DE LOTE A LOTE DE MEDIO DE CULTIVO. PARA ESTE FIN SE PUEDE USAR UNA PRUEBA DE AGLUTINACION RAPIDA SOBRE PORTA PONIENDO EN CONTACTO LA COLONIA CON UN ANTISUERO SALMONELLA POLIVALENTE.

CONFIRMACION DE LAS COLONIAS SOSPECHOSAS

SELECCION DE LAS COLONIAS SOSPECHOSAS: DE CADA PLACA DE MEDIO SELECTIVO SE ESCOGEN 5-6 COLONIAS TIPICAS O SOSPECHOSAS PARA SER CONFIRMADAS.

SEMBRAR LAS COLONIAS SELECCIONADAS SOBRE LA SUPERFICIE DE PLACAS DE AGAR LACTOSA-BILIS-CRISTAL VIOLETA-ROJO NEUTRO (V.R.B.) PARA OBTENER LAS AISLADAS.

INCUBAR A 37 AVEINTICUATRO HORAS.

SE ELIGEN LAS COLONIAS NO COLOREADAS (LACTOSA NEGATIVAS) PARA CONFIRMARLAS BIOQUIMICA Y SEROLOGICAMENTE.

CONFIRMACION BIOQUIMICA

SIEMBRA E INCUBACION DEL MEDIO: SEMBRAR MEDIANTE ASA DE CULTIVO, CON COLONIAS PURAS LACTOSA NEGATIVAS, LOS SIGUIENTES MEDIOS DE CULTIVO:

AGAR T.S.I.: SEMBRAR EN ESTRIA LA SUPERFICIE DEL AGAR Y POR PICADURA EN EL FONDO. INCUBAR VEINTICUATRO-CUARENTA Y OCHO HORAS A 37 C.

LECTURA:

FONDO SUPERFICIE INCLINADA

AMARILLO = FERMENTACION DE GLUCOSA.

AMARILLO LACTOSA Y/O SACAROSA FERMENTADA.

ROJO O SIN CAMBIO = NO FERMENTACION DE LA GLUCOSA.

ROJO O SIN CAMBIO = NI LACTOSA NI SACAROSA FERMENTADA.

BURBUJAS O GRIETAS = GAS A PARTIR DE LA GLUCOSA.

AGAR UREA: SEMBRAR EN LA SUPERFICIE DEL AGAR INCLINADO. INCUBAR CUARENTA Y OCHO HORAS A 37 C.

SE HACE LA LECTURA. EN CASO POSITIVO EL COLOR ROJO FENOL CAMBIA A ROSA, Y MAS TARDE A CEREZA INTENSO.

MEDIO PARA DECARBOXILACION DE LISINA: SEMBRAR EXACTAMENTE DEBAJO DEL MEDIO LIQUIDO. INCUBAR VEINTICUATRO HORAS A 37 C.

LA REACCION POSITIVA SE MANIFIESTA POR UN COLOR PURPURA. AMARILLO INDICA REACCION NEGATIVA.

REACCION DE VOGES-PROSKAUER: SE SIEMBRA EN EL MEDIO MR-VP LA COLONIA SOSPECHOSA YA SE HA DESCRITO LA TECNICA PARA ESTA REACCION CON ANTERIORIDAD.

VER 3. IDENTIFICACION ESCHERICHIA COLI, APARTADO <TECNICA>, PUNTO B).

REACCION DEL INDOL: SEMBRAR SOBRE AGUA DE TRIPTONA (TW) LA COLONIA SOSPECHOSA YA SE HA DESCRITO LA TECNICA PARA ESTA REACCION CON ANTERIORIDAD. VER 3.

IDENTIFICACION ESCHERICHIA COLI, APARTADO <TECNICA>, PUNTO A).

6. INVESTIGACION DE SHIGELLA:

ES LA DETERMINACION DE LA PRESENCIA O AUSENCIA DE LOS MICROORGANISMOS PERTENECIENTES A ESTE GENERO POR METODOS ADECUADOS.

MATERIAL:

GRADILLAS.

PIPETA ESTERILES DE 1 ML.

ASAR DE CULTIVO.

PLACAS DE PETRI ESTERILES DE 90 Y 150 MM DE DIAMETRO.

ESTUFA DE CULTIVO.

MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS:

A) PREPARACION DEL CALDO TRIPTONA SOJA (T.S.B.):

SE DISUELVEN LOS INGREDIENTES POR CALENTAMIENTO HASTA EBULLICION. SE AJUSTA EL PH 7,3 Y SE DISTRIBUYE EL MEDIO EN MATRACES DE 500 ML, A RAZON DE 225 ML.

ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE DURANTE VEINTE MINUTOS A 121 C.

B) PREPARACION DEL CALDO DE ENRIQUECIMIENTO EE DE MOSSEL CONCENTRADO:

DISOLVER. AJUSTAR EL PH A 7,2. DISTRIBUIR EN MATRACES DE 100 ML A RAZON DE 10 ML Y CALENTAR A <BAÑO MARIA> A 100C DURANTE TREINTA MINUTOS. ENFRIAR A CHORRO DE AGUA FRIA. ESTE MEDIO NO NECESITA AUTOCLAVE.

C) PREPARACION DE AGAR XILOSA-LISINA-DECARBOXILASA (XLD):

DISOLVER POR CALENTAMIENTO, EVITANTO QUE ESTE SEA PROLONGADO. ENFRIAR INMEDIATAMENTE EN AGUA HASTA ALCANZAR LOS 50 C. PUEDE APARECER UN PRECIPITADO QUE NO INTERFIERE NI EN EL CRECIMIENTO NI EN LAS CARACTERISTICAS DEL GERMEN. SE VIERTE SOBRE PLACAS DE PETRI DE 150 MM. ESTE MEDIO, UNA VEZ PREPARADO, PRESENTA COLORACION ROJIZA. NO PRECISA AUTOCLAVE.

D) PREPARACION DE AGAR COMUN.

HUMEDECER EL AGAR DURANTE QUINCE MINUTOS.DISOLVER POR CALENTAMIENTO TODOS LOS INGREDIENTES Y LLEVAR A EBULLICION HASTA SU COMPLETA DISOLUCION. AJUSTAR EL PH A 7.3, DISTRIBUIR EN TUBOS DE ENSAYO Y ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE DURANTE QUINCE MINUTOS A 121 C. COLOCAR LOS TUBOS PARA OBTENER AGAR INCLINADO.

E) PREPARACION DE AGAR HEKTOEN.

DISOLVER POR CALENTAMIENTO HASTA EBULLICION. AJUSTAR EL PH A 7.5. ENFRIAR A 60 C Y DISTRIBUIR EN PLACAS DE PETRI ESTERILES. NO NECESITA AUTOCLAVE.

F) PREPARACION DE AGAR SEMISOLIDO EN TUBO EN U.

DISOLVER POR CALENTAMIENTO. AJUSTAR EL PH A 7.2 Y DISTRIBUIR A RAZON DE UNOS 10 ML EN TUBOS CON FORMA DE U DE 200 MM DE LONGITUD Y 10 MM DE DIAMETRO. ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE DURANTE VEINTE MINUTOS A 121 C.

G) PREPARACION DE AGAR DE SIMMONS PARA COMPROBAR LA ASIMILACION DEL CITRATO.

DISOLVER POR CALENTAMIENTO. AJUSTAR EL PH A 6.8. REPARTIR EN TUBOS DE ENSAYO Y ESTERILIZAR DURANTE VEINTE MINUTOS A 121 C. DEJAR SOLIDIFICAR EN POSICION INCLINADA.

H) PREPARACION DEL AGAR-HIERRO-TRIPLE AZUCAR (T. S. I.).

DISOLVER PERFECTAMENTE POR CALENTAMIENTO HASTA EBULLICION. AJUSTAR EL PH A 7.3. DISTRIBUIR EN TUBOS, LLENANDOLOS A 13 DE SU CAPACIDAD. ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE A 120C DURANTE QUINCE MINUTOS. DEJAR SOLIDIFICAR EN POSICION INCLINADA, DE TAL FORMA QUE QUEDE TAMBIEN UN FONDO PROFUNDO.

I) PREPARACION DEL REACTIVO PARA LA PRUEBA DE LA CITOCROMO-OXIDASA.

GOTAS DE REACTIVO Y SE COLOCA SOBRE UNA PORTA DENTRO DE UNA PLACA DE PETRI, QUEDANDO ASI PREPARADO PARA USO INMEDIATO.

J) PREPARACION DEL MEDIO PARA LA UTILIZACION DE AZUCARES.

K) PREPARACION DEL MEDIO PARA LA INVESTIGACION DE LA DEGRADACION DEL MALONATO.

DISOLVER POR CALENTAMIENTO. AJUSTAR EL PH A 6,4. REPARTIR EN TUBOS DE 120 12 MM A RAZON DE 3 ML. ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE DURANTE DIEZ MINUTOS A 115 C. EL MEDIO TIENE COLOR AMARILLO VERDOSO A PH 6,4.

L) PREPARACION DEL MEDIO DE CHRISTENSEN PARA DETERMINACION DE LA HIDROLISIS DE LA UREA.

DISOLVER POR CALENTAMIENTO. AJUSTAR EL PH A 6,8. ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE DURANTE VEINTE MINUTOS A 115 C. ENFRIAR A 50 C E INTRODUCIR ASEPTICAMENTE 5 ML DE SOLUCION DE UREA AL 40 POR 100 ESTERIL. MEZCLAR BIEN Y DISTRIBUIR A RAZON DE 10 ML EN TUBOS DE ENSAYO ESTERILES Y DEJAR SOLIDIFICAR EN POSICION INCLINADA.

M) PREPARACION DE CALDO PARA DETERMINACION DE LISINA DECARBOXILASA.

DISOLVER. REPARTIR A RAZON DE 5 ML POR TUBO CON TAPON DE ROSCA Y ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE DURANTE DIEZ MINUTOS A 120 C.

N) PREPARACION DEL MEDIO AL ACETATO DE TRABULSI Y EDWARDS.

DISOLVER. AJUSTAR EL PH A 7. REPARTIR EN TUBOS A RAZON DE 3 ML. ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE DURANTE QUINCE MINUTOS A 121 C. DEJAR SOLIDIFICAR EN POSICION INCLINADA, DE FORMA QUE SE OBTENGA UN FONDO DE 1 CM. EL MEDIO TERMINADO TIENE TONALIDAD VERDE.

TECNICA: PARA ESTA INVESTIGACION, LA MUESTRA REPRESENTATIVA DEBE SER, COMO MINIMO, DE 100 G. DE ESTA CANTIDAD SE TOMARAN 25 G DE DISTINTAS ZONAS PARA HACER EL ANALISIS. LA TOMA DE LA MUESTRA SE HARA CON TODAS LAS PRECAUCIONES ASEPTICAS. EN EL CASO DE ALIMENTOS CONGELADOS, EL PRODUCTO DEBE SER SOMETIDO A DESCONGELACION POR PERMANENCIA EN FRIGORIFICO, ENTRE 2 Y 5 C, DURANTE DIECIOCHO HORAS Y, A CONTINUACION, SE HARA LA TOMA DE LA MUESTRA PARA EL ANALISIS.

UNA VEZ TOMADA LA MUESTRA, Y SI LO REQUIERE EL ALIMENTO A ANALIZAR, SE PROCEDERA A SU TRITURACION-HOMOGENEIZACION, EMPLEANDO UN TRITURADOR ADECUADO.

LA TRITURACION DEBE HACERSE MEZCLANDO EL PRODUCTO CON UNA CANTIDAD SUFICIENTE DEL DILUYENTE (T.S.B.) Y UNA VEZ TRITURADO, SE LE INCORPORARA MAS DILUYENTE, HASTA COMPLETAR 225 ML. LA MEZCLA ASI OBTENIDA SE MANTIENE DURANTE DOS HORAS A TEMPERATURA DE LABORATORIO. EN ESTA FASE SE INTENTA REVIVIFICAR LAS POSIBLES SHIGELLA Y SALMONELLA. PASADAS LAS DOS HORAS, SE TOMAN 10 ML Y SE SIEMBRAN EN UN MATRAZ CONTENIENDO 10 ML DEL MEDIO EE DE MOSSEL CONCENTRADO.

EL MEDIO SEMBRADO SE LLEVA A ESTUFA A 41C DURANTE VEINTICUATRO HORAS. ESTA ES LA FASE DE ENRIQUECIMIENTO.

TRANSCURRIDO EL PERIODO DE INCUBACION, Y A PARTIR DEL MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO EE DE MOSSEL, SE SIEMBRA CON ASA DE CULTIVO SOBRE:

PLACAS DE AGAR-XILOSA-LISINA-DECARBOXILASA (XLD).

PLACAS DE AGAR HEKTOEN.

ESTOS MEDIOS SON SELECTIVOS PARA AISLAMIENTO DE SHIGELLA Y SALMONELLA YA QUE ELIMINAN GRAN PARTE DE LA FLORA QUE PUEDA ESTORBAR EL CRECIMIENTO DE ESTOS MICROORGANISMOS.

EN EL AGAR XLD SE PUEDE INVESTIGAR LA FERMENTACION DE TRES AZUCARES: XILOSA, LACTOSA Y SACAROSA, QUE, EN CASO POSITIVO, HACEN VIRAR EL MEDIO A COLOR AMARILLO GRACIAS AL INDICADOR ROJO FENOL. EL CITRATO FERRICO AMONICO SIRVE PARA INDICAR LA FORMACION DE SULFURO DE HIERRO QUE SE MANIFIESTA POR UN ENNEGRECIMIENTO DE LAS COLONIAS. LOS GERMENES QUE DECARBOXILAN LA LISINA SE IDENTIFICAN POR LA APARICION DE UN COLOR ROJO PURPURA ALREDEDOR DE LAS COLONIAS, COMO CONSECUENCIA DEL AUMENTO DEL PH.

EN LA COMPOSICION DEL AGAR HEKTOEN INTERVIENEN TRES AZUCARES: LACTOSA, SACAROSA Y SALICINA; EL INDICADOR ES EL AZUL DE BROMOTIMOL. EL CITRATO FERRICO AMONICO SIGUE TENIENDO EN ESTE MEDIO EL PAPEL DE INDICAR LA FORMACION DE SULFURO DE HIERRO. EL SISTEMA INDICADOR ES MENOS TOXICO QUE EN OTROS MEDIOS, LO QUE FAVORECE EL DESARROLLO DEL GENERO SHIGELLA.

LAS COLONIAS SOSPECHOSAS POR SUS CARACTERISTICAS DE CRECIMIENTO SOBRE ESTOS MEDIOS, SE AISLAN Y SE SIEMBRAN EN TUBOS DE AGAR COMUN INCLINADO O EN PLACAS DE AGAR COMUN. INCUBACION A 37 C HASTA EL DIA SIGUIENTE. CON EL CRECIMIENTO OBTENIDO EN ESTOS MEDIOS A PARTIR DE LAS COLONIAS AISLADAS, SE PROCEDE A LA IDENTIFICACION DE LAS MISMAS, CON LA SIGUIENTE PAUTA:

ESTUDIO MICROSCOPICO DE LOS GERMENES, PREVIA COLORACION POR EL METODO DE GRAM.

COMPROBACION DE LA MOTILIDAD.

PRUEBA DE LA CITOCROMO-OXIDASA.

MODO DE ACTUAR SOBRE LOS AZUCARES: GLUCOSA, LACTOSA, SACAROSA, SALICINA.

PRUEBA DE LA HIDROLISIS DE LA UREA.

PRUEBA PARA DETERMINAR LA DECARBOXILACION DE LA LISINA.

PRUEBA PARA DETERMINAR LA UTILIZACION DE CITRATO.

PRUEBA PARA INVESTIGAR LA DEGRADACION DEL MALONATO.

MEDIO COMPLEMENTARIO PARA EL ESTUDIO DE SHIGELLA.

A) ESTUDIO DE LA MORFOLOGIA DE LOS GERMENES QUE INTEGRAN LAS COLONIAS AISLADAS, PREVIA COLORACION POR EL METODO DE GRAM.

SE PREPARA UN FROTIS SOBRE PORTA LIMPIO Y DESENGRASADO, A PARTIR DE UNA SUSPENSION BACTERIANA DEL CULTIVO CRECIDO SOBRE AGAR COMUN. EL FROTIS DEBE SER FINO Y REGULAR. DEJAR SECAR A TEMPERATURA DE LABORATORIO. FIJAR POR EL CALOR DE LA LLAMA DEL MECHERO Y DEJAR ENFRIAR ANTES DE INICIAR LA COLORACION:

SE PROCEDE A LA COLORACION CON EL COLORANTE VIOLETA DE GENCIANA FILTRADO PARA EVITAR LA FORMACION DE PRECIPITADOS Y SE LE DEJA ACTUAR DURANTE UN MINUTO.

A CONTINUACION DEBE ACTUR EL MORDIENTE (LUGOL), QUE SE VERTERA SOBRE EL PORTA UNA VEZ DESECHADO EL VIOLETA DE GENCIANA, SIN NECESIDAD DE LAVADO DE AGUA. EL TIEMPO DE ACTUACION DEL MORDIENTE DEBE SER IGUAL O ALGO MAYOR QUE EL DEL COLORANTE.

LA FASE SIGUIENTE ES LA DECOLORACION CON ALCOHOL ACETONA, UNA VEZ DESECHADO EL LUGOL, ACTUANDO HASTA QUE EL DECOLORANTE SALGA SIN COLOR.

AL FINAL DE ESTA FASE SE HACE UN LAVADO CON AGUA.

LA COLORACION DE FONDO SE HACE CON FUCHINA DILUIDA AL 1/10 DEJANDOLA ACTUAR UNOS VEINTE SEGUNDOS Y LAVANDO FINALMENTE CON AGUA. LA PREPARACION YA COLOREADA SE SECA PERFECTAMENTE ENTRE PAPEL DE FILTRO.

EL FROTIS COLOREADO SE EXAMINA AL MICROSCOPIO EMPLEANDO OBJETIVO DE INMERSION.

SEGUN LA COLORACION DE GRAM, LAS BACTERIAS SE DIVIDEN EN DOS GRANDES GRUPOS:

GRAM POSITIVAS.

GRAM NEGATIVAS.

LAS BACTERIAS GRAM POSITIVAS CONSERVAN SU COLORACION POR EL VIOLETA DE GENCIANA DESPUES DE SER DECOLORADAS CON EL ALCOHOL ACETONA.

LAS BACTERIAS GRAM NEGATIVAS SE DECOLORAN CON EL ALCOHOL ACETONA Y SE TIÑEN POR LA FUCHINA EN ROSA.

B) COMPROBACION DE LA MOTILIDAD.

POR ESTA COMPROBACION SE PUEDE EMPLEAR EL AGAR DE CULTIVO SEMISOLIDO EN UN TUBO EN U. SE SIEMBRA POR UNA DE LAS RAMAS DEL TUBO, INCUBANDO LUEGO A 37C DURANTE VEINTICUATRO-CUARENTA Y OCHO HORAS Y COMPROBANDO SI LOS GERMENES QUE SE HAN SEMBRADO TIENDEN A ALCANZAR, EN SU CRECIMIENTO, LA RAMA OPUESTA A LA DE LA SIEMBRA, LO QUE INDICA QUE EL GERMEN EN CUESTION ES MOVIL. SI EL CRECIMIENTO SE LIMITA A LA LINEA DE SIEMBRA, EL GERMEN ES INMOVIL.

C) PRUEBA DE LA CITOCROMO-OXIDASA.

COMO REGLA GENERAL, TODAS LAS ENTEROBACTERIACEAE SON CITOCROMO-OXIDASA NEGATIVAS, ASI QUE ES FUNDAMENTAL SU INVESTIGACION PARA CLASIFICAR UN BACILO GRAM NEGATIVO DENTRO DE ESTA FAMILIA.

PARA ESTA PRUEBA SE USA PAPEL IMPREGNADO DE REACTIVO O LAS TIRAS QUE SE VENDEN EN EL COMERCIO. ESTAS TIRAS SE PONEN SOBRE PORTA Y EN EL INTERIOR UNA PLACA DE PETRI. CON PIPETA DE PASTEUR CERRADA EN SU PUNTA, SE TOMA UNA PORCION DE CULTIVO EN AGAR COMUN Y SE EXTIENDE SOBRE EL PAPEL IMPREGNADO DEL REACTIVO. CUANDO LAS BACTERIAS SON OXIDASA POSITIVAS, APARECE SOBRE EL PAPEL UNA TONALIDAD MARRON ROJIZA, QUE SE VA OSCURECIENDO. ESTO NO OCURRE CON LOS GERMENES OXIDASA NEGATIVOS.

D) MODO DE ACTUAR SOBRE LOS AZUCARES: GLUCOSA, LACTOSA, SACAROSA.

A PARTIR DEL CULTIVO SOBRE AGAR COMUN SE HACE UNA SIEMBRA EN EL MEDIO AGAR HIERRO TRIPLE AZUCAR, T.S.I., PRIMERO, ABUNDANTEMENTE EN LA INCLINACION DEL MEDIO, Y LUEGO, EN EL FONDO POR PICADURA. INCUBAR A 37 C DE DIECIOCHO A CUARENTA Y OCHO HORAS.

EN ESTE MEDIO SE MANIFIESTA LA FERMENTACION DE LOS AZUCARES POR UN VIRAJE AL AMARILLO DEBIDO AL INDICADOR ROJO FENOL. EL GAS SE DETECTA POR LA APARICION DE BURBUJAS O GRIETAS EN EL MEDIO DE CULTIVO. LOS GERMENES QUE PRODUCEN SH2 DAN LUGAR A UN ENNEGRECIMIENTO, AL FORMARSE SULFURO DE HIERRO.

E) MODO DE ACTUAR SOBRE LA SALICINA .

ESTA DETERMINACION, ASI COMO OTRAS EN LAS QUE SE INTENTE INVESTIGAR EL COMPORTAMIENTO DE LOS GERMENES SOBRE DISTINTOS AZUCARES, SE PUEDE LLEVAR A CABO SOBRE EL MEDIO PARA FERMENTACION DE AZUCARES.SE PROCEDE DEL MODO SIGUIENTE: CON UNA PINZA ESTERIL SE INTRODUCE UN DISCO IMPREGNADO EN SALICINA EN EL INTERIOR DE UN TUBO CONTENIENDO AGAR BLANDO EXENTO DE AZUCARES. EN ESTE TUBO SE HACE UNA SIEMBRA POR PICADURA, A PARTIR DEL CULTIVO OBTENIDO SOBRE AGAR COMUN, TENIENDO LA PRECAUCION DE HACER LA PICADURA HASTA LA MITAD DEL MEDIO, PARA QUE EL FONDO DEL MISMO SIRVA DE TESTIGO. EMPUJAR LIGERAMENTE EL DISCO PARA QUE QUEDE CUBIERTO UNOS 4 MILIMETROS DENTRO DEL AGAR. SE INCUBA A 37 C Y SE HACEN LECTURAS A PARTIR DE DIECIOCHO HORAS Y A INTERVALOS REGULARES.

CUANDO SE PRODUCE LA FERMENTACION DEL AZUCAR APARECE UNA TONALIDAD AMARILLO LIMON, PRIMERO A NIVEL DEL DISCO Y DESPUES EN UNA ZONA MAS AMPLIA. CUANDO SE FORMA GAS APARECEN BURBUJAS ALREDEDOR DEL DISCO, EN LA SUPERFICIE O A LO LARGO DE LA PICADURA. CUANDO NO HAY FERMENTACION EL INDICADOR NO HACE VIRAR EL MEDIO. EN EL CASO DE UNA BACTERIA ALCALINIZANTE LA COLORACION QUE APARECE ES ROJO GROSELLA.

EL PROCEDIMIENTO DESCRITO PARA LA SALICINA SE PUEDE UTILIZAR PARA CUALQUIER AZUCAR, CAMBIANDO LOS DISCOS IMPREGNADOS CON EL AZUCAR QUE INTERESE EN CADA CASO.

F) PRUEBA PARA LA DETERMINACION DE LA HIDROLISIS DE LA UREA .

POR ESTA PRUEBA SE INVESTIGA LA PRESENCIA DE UNA UREASA EN ALGUNOS GERMENES, QUE INTERVIENE PARA TRANSFORMAR LA UREA EN CARBONATO AMONICO, ALCALINIZANDO LOS MEDIOS PREPARADOS A ESTE FIN.

DEL CULTIVO OBTENIDO SOBRE AGAR COMUN SE SIEMBRA ABUNDANTEMENTE SOBRE LA SUPERFICIE INCLINADA DEL AGAR DE CHISTENSEN. INCUBACION A 37 C ENTRE DIECIOCHO Y CUARENTA Y OCHO HORAS. LA HIDROLISIS DE LA UREA SE MANIFIESTA POR UNA ALCALINIZACION DEL MEDIO, QUE TOMA TONALIDAD ROSA Y LUEGO ROJA. ES ACONSEJABLE PONER UN TUBO TESTIGO SIN UREA PARA COMPROBAR QUE LA ALCALINIZACION NO SE DEBE A UNA DEGRADACION DE LA PEPTONA QUE CONTIENE EL MEDIO.

G) PRUEBAS PARA LA DETERMINACION DE LA DESCARBOXILACION DE LA LISINA . MUCHAS BACTERIAS ELABORAN ENZIMAS CAPACES DE ATAR ALGUNOS AMINOACIDOS. ESTOS ENZIMAS, DESCARBOXILASAS, ACTUANDO SOBRE LA LISINA, EN MEDIO ACIDO, LA TRANSFORMAN EN CADAVERINA, QUE SE DETECTA POR EL VIRAJE QUE SE PRODUCE DEL AMARILLO AL VIOLETA.

PARA REALIZAR ESTA PRUEBA SE HACE UNA SUSPENSION EN SOLUCION SALINA O EN SOLUCION RINGER AL 1/4, A PARTIR DE UN CULTIVO DE VEINTICUATRO HORAS SOBRE AGAR COMUN. CINCO GOTAS DE LA SUSPENSION SE SIEMBRAN SOBRE EL MEDIO Y SE CUBRE ESTE ULTIMO CON UNA CAPA DE PARAFINA ESTERIL, INCUBANDOSE A 37 C. LOS TUBOS HAN DE OBSERVARSE A DIARIO DURANTE CUATRO DIAS. LA APARICION DE UNA TONALIDAD VIOLETA O ROJA VIOLETA INDICA QUE HA HABIDO UTILIZACION DE LA LISINA Y, POR TANTO, LA REACCION ES POSITIVA. LA PERMANENCIA DE LA TONALIDAD AMARILLA DEL MEDIO INDICA REACCION NEGATIVA.

H) PRUEBA PARA DETERMINAR LA UTILIZACION DEL CITRATO .

ALGUNAS BACTERIAS POSEEN UN CITRATO PERMEASA QUE LES PERMITE UTILIZAR EL CITRATO COMO FUENTE DE CARBONO; POR TANTO, UNICAMENTE LOS GERMENES QUE POSEEN ESTA CARACTERISTICA PUEDEN CRECER EN UN MEDIO SINTETICO CUYA UNICA FUENTE DE CARBONO ES EL CITRATO SODICO. PARA DETERMINAR ESTA PARTICULARIDAD SE USA EL MEDIO AL CITRATO DE SIMMONS.

PARA REALIZAR LA SIEMBRA SOBRE ESTE MEDIO SE EMPLEA UN CULTIVO OBTENIDO SOBRE AGAR COMUN, PERO NUNCA UN CULTIVO LIQUIDO, PUES LO MISMO EL CALDO QUE EL AGUA DE PEPTONA PUEDEN LLEVAR ELEMENTOS NUTRITIVOS QUE DEN LUGAR A RESULTADOS ERRONEOS. EL INOCULO DE SIEMBRA DEBE SER ESCASO Y SE DEBE HACER UNA ESTRIA DE SIEMBRA UNICA. EL MEDIO SEMBRADO SE INCUBARA A 37C DURANTE VEINTICUATRO HORAS. SI AL CABO DE ESTE TIEMPO HAY CRECIMIENTO ABUNDANTE CON O SIN ALCALINIZACION (SE PRODUCE UN VIRAJE POR LIBERACION DE AMONIACO CON LA ALCALINIZACION) SE TRATA DE GERMENES CITRATO POSITIVOS. CUANDO NO HAY CRECIMIENTO A LO LARGO DE LA LINEA DE SIEMBRA, LOS GERMENES SON CITRATOS NEGATIVOS.

I) PRUEBA PARA INVESTIGAR LA DEGRADACION DEL MALONATO .

ES UN MEDIO COMPLETAMENTARIO PARA LA IDENTIFICACION DE SHIGELLA. PARA DETERMINAR LA DEGRADACION DEL MALONATO SE UTILIZA EL MEDIO SEMBRANDO EN EL MISMO A PARTIR DE UN CULTIVO SOBRE AGAR. INCUBAR A 37C DURANTE SETENTA Y DOS HORAS. LOS MICROORGANISMOS MALONATO POSITIVOS VIRAN EL MEDIO A AZUL. LOS MALONATOS NEGATIVOS NO MODIFICAN EL MEDIO.

J) MEDIO COMPLEMENTARIO PARA EL ESTUDIO DE SHIGELLA .

EL MEDIO AL ACETATO DE TRABULSI Y EDWARDS SE UTILIZA PARA LA DIFERENCIACION ENTRE ALCALESCENS-DISPAR Y SHIGELLA, YA QUE EL ESTUDIO BIOQUIMICO PUEDE DAR LUGAR A CONFUSION. EL 95 POR 100 DE LAS CEPAS DE ALCALESCENS-DISPAR CRECEN EN ESTE MEDIO MIENTRAS QUE LAS SHIGELLA NO LO HACEN NUNCA.

A PARTIR DE UNA SUSPENSION EN SOLUCION SALINA O SOLUCION RINGER A 1/4, OBTENIDA DE UN CULTIVO PURO SOBRE AGAR COMUN, SE HACE UNA SIEMBRA SOBRE LA SUPERFICIE INCLINADA DEL AGAR AL ACETATO DE TRABULSI Y EDWARDS. INCUBAR A 37C DURANTE CUARENTA Y OCHO-SETENTA Y DOS HORAS. LAS CEPAS QUE DEGRADAN EL ACETATO PRODUCEN UNA ELEVACION DEL PH DEL MEDIO DE CULTIVO, QUE VIRA SU COLOR VERDE ORIGINAL A AZUL. LA LECTURA SE DEBE HACER DIARIAMENTE DURANTE SIETE DIAS. LA IDENTIFICACION DE LAS SHIGELLA SE PUEDE COMPLEMENTAR CON PRUEBAS SEROLOGICAS, EMPLEANDO SUEROS AGLUTINANTES, SOBRE TODO PARA DIFERENCIARLAS DE LOS ALCALESCENS-DISPAR Y E. COLI, QUE SE ASEMEJAN A LAS SHIGELLA EN ALGUNOS ASPECTOS BIOQUIMICOS. DE TODAS FORMAS, SON DE MAS VALOR LAS PRUEBAS BIOQUIMICAS QUE LAS SEROLOGICAS CUANDO SE TRATA DEL GENERO SHIGELLA.

NOTA: DENTRO DE LA PRACTICA DE REALIZACION DE TODOS LOS METODOS ANALITICOS ANTERIORMENTE EXPUESTOS, AL FUNDIR LA MUESTRA DE HELADO PARA SU ANALISIS SE MANTENDRA ESTA COMO MAXIMO DIEZ MINUTOS A 45 C.